细胞免疫荧光染色流程

本页面整理了实验室常规的细胞免疫荧光染色（IF）基础步骤，所有常规操作均在室温下进行。

🧪 试剂配制参考

在开始实验前，请提前配制好以下常用工作液：

• 0.2% Triton X-100 (破膜液): 9.98 mL 纯水 + 20 μL Triton X-100。
• 5% BSA (封闭液): 9.5g PBS + 0.5g BSA。
• 一抗稀释 (以 1:250 为例): 4 μL 一抗 (如靶向 cacna1c 的 Rabbit anti-ZO-1) + 996 μL PBS。
• 二抗稀释 (以 1:500 为例): 2 μL 二抗 + 998 μL PBS。

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📋 染色操作步骤

1. 细胞清洗: 将培养好的细胞取出，使用预先在水浴锅中加热至 37℃ 的 PBS 冲洗 2 遍，每次 3 分钟。

2. 细胞固定: 加入细胞固定液，固定 20 - 30 分钟。

3. 洗涤: 用 PBS 清洗 2 次，每次 5 分钟。

4. 细胞通透 (破膜): 加入 0.2% Triton X-100 溶液渗透 10 分钟，以增加细胞通透性。

   ⚠️ 关键提示

   如果你本次实验需要染定的是膜蛋白，请直接跳过此步骤，不需要进行破膜操作！

5. 洗涤: 用 PBS 溶液清洗 2 次，每次 3 分钟。

6. 封闭: 加入 5% BSA 封闭液，室温封闭 45 分钟。

7. 孵育一抗: 加入稀释好的一抗溶液，将其放置在湿盒中，转移至 4℃ 冰箱过夜孵育。

8. 洗涤: 第二天取出后，用 PBS 清洗 3 次，每次 3 分钟。

9. 孵育二抗: 加入稀释好的二抗溶液，注意避光，孵育 30 分钟。

10. 重复洗涤: 用 PBS 洗 2 次，每次 3 分钟；随后为了彻底洗净背景，再用 PBS 洗 2 次，每次 3 分钟。

11. 染核及保存: 最后加入 DAPI 染液（确保液体没过细胞表面），随后放置在湿盒中避光保存，等待上机拍摄。