细胞传代标准操作规程 (SOP)

本指南整理了实验室常规细胞传代的操作步骤、实验目的与关键注意事项。

⚠️ 无菌操作核心准则

在进行任何操作之前，以及使用任何操作台外的工具之前，都要喷洒酒精进行消毒！

📋 标准操作步骤

1. 实验准备

• 戴好手套并进行彻底消毒。
• 从 CO₂ 细胞培养箱中拿出需要传代的细胞，放入洁净操作台内。

2. 废液处理与清洗

• 吸取培养瓶中的废液，弃入废液缸中。
• 加入 5 ml 的 D-Hanks 液清洗细胞，一般清洗 2 次，洗完后的废液放入废液缸。

3. 胰酶消化

• 往培养瓶中打入 2 ml 胰蛋白酶。 加入后将液体平摊开并轻轻晃动，随后放入细胞培养箱中孵育 4～5 分钟。

💡 目的与提示

• 消化目的： 消除细胞与细胞之间、以及细胞与培养瓶壁面之间的连接物质。
• 试剂预热： 一般建议提前 30 分钟～1 小时将胰酶从冰箱冷冻层拿出，放入 37℃ 恒温箱待用。
• 控制时间： 一般消化控制在 10 分钟之内，细胞就不会受到损伤。

4. 终止消化

• 孵育完成后，加入 2 ml 完全培养基，轻轻晃一晃。
• 目的： 终止胰酶对细胞的消化作用。

5. 细胞吹打与收集

• 吹打： 先把培养瓶壁面残余的细胞吹下来，然后将移液管靠近底部反复吹打约 20 下，为了把细胞彻底打散。
• 收集： 吹打完成后，把细胞悬液吸取出来，吸入放到 15 ml 的离心管中。

6. 离心沉淀

• 将离心管在离心机中对称放置，盖上盖子。
• 设置离心参数（切换转速和时间）：一般设置为 1000 转/min，离心 5 分钟，确认后启动。
• 离心完成后，细胞会沉淀到管底的最下层（肉眼可以看到一层白色的细胞沉淀）。 吸取上清液放入废液缸，千万注意不要吸到细胞沉淀。

7. 重悬与分盘

• 往离心管内打入 2 ml 新鲜培养液。
• 把枪头靠近液面中底部进行吹打，这样可以减少气泡的产生。
• 吹打均匀后，将细胞悬液吸出，分别放入新的 T25 培养瓶中，并在瓶身标注好日期。

8. 试剂归位与台面清理

• 将存放培养基、D-Hanks 液和胰酶的瓶子拧紧，并用封口胶带封住（尤其要注意存放培养基的瓶子）。
• 储存要求： 胰酶放回冷冻保存，D-Hanks 和培养基放回冷藏保存。
• 清理废液和垃圾，将容器全部喷洒酒精进行消毒。
• 用纱布喷上酒精，将操作台彻底擦拭一遍。

9. 紫外杀菌收尾

• 关上操作台挡板，关灯，开启 UV 紫外光，使用遥控器定时 1 小时。

⚠️ 紫外消毒注意事项

开启紫外线消毒时要关闭通风。 因为紫外光消毒的原理是紫外线照射空气产生臭氧，依靠臭氧来杀菌，通风会导致臭氧流失。